La sfârșitul anilor 1980, pe măsură ce avansată. Cu toate acestea, microscopia confocală cu laser are un defect major: deschiderea confocală nu numai că blochează fluorescența generată în afara punctului focal, dar blochează și fluorescența generată de punctul focal care este împrăștiat de țesuturile biologice, rezultând o scădere a eficienței de colectare a fluorescenței, iar adâncimea imaginii nu poate fi mai mare de 100 de micrometri. Prin urmare, în anii 1990, a luat ființă microscopia cu fluorescență cu doi fotoni care combină microscopia confocală cu laser și tehnologia excitației cu doi fotoni. Lungimea de undă de excitație a procesului de absorbție cu doi fotoni este în general stabilită în intervalul ferestrei bio-optice de 680-1080 nm, ceea ce evită deteriorarea luminii ultraviolete asupra celulelor sau organismelor vii și pătrunde mai adânc.
În prezent, cel mai utilizat microscop cu fluorescență cu doi fotoni este laserul cu piatră prețioasă de titan femtosecundă, care este voluminos și costisitor, ceea ce limitează aplicarea microscopiei cu fluorescență cu doi fotoni în diferite domenii, cum ar fi științele vieții, chimie și medicină. Așadar, în unele domenii, cum ar fi diagnosticul medical, oamenii au încercat să folosească lasere cu stare solidă sub nanosecunde compacte și accesibile ca sursă de lumină standard.
Principiul de bază al excitației cu doi fotoni este că, atunci când o moleculă fluorescentă este excitată sub o densitate mare de fotoni, ea absoarbe simultan doi fotoni cu lungime de undă lungă și apoi radiază spontan fotoni fluorescenți înapoi la starea fundamentală după salturi de excitare și procese de relaxare. În comparație cu microscopia convențională cu fluorescență cu excitație cu un singur foton, generarea de semnal optic în microscopia cu fluorescență cu excitație cu doi fotoni este neliniară, lumina de excitație fiind o sursă de lumină cu lungime de undă mai mare, cu putere de vârf mai mare, iar fotonii fluorescenți emiși având o lungime de undă. puțin mai mare de jumătate din lungimea de undă de excitație.
Microscopia cu fluorescență cu doi fotoni folosește o sursă de lumină cu laser în infraroșu apropiat, iar natura sa neliniară nu necesită o deschidere confocală. Prin urmare, în comparație cu microscopia confocală, microscopia cu fluorescență cu doi fotoni are următoarele avantaje:
- Adâncime mare de imagine și deteriorare optică redusă;
- Nu este necesară deschiderea confocală, iar eficiența colectării fluorescenței este mult îmbunătățită;
- Rezoluție spațială și contrast mai mare;
- Interval mic de excitație, fototoxicitate mică și albire;
- Lungimile de undă de emisie și excitare sunt îndepărtate, evitând suprapunerea spectrală;
